堿性磷酸酶同工酶檢測試劑盒(抑制敏感法)的產(chǎn)品組成

 堿性磷酸酶同工酶檢測試劑盒(抑制敏感法)的產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介：

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，簡稱 ALP 或 AKP)為一類磷酸酯酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織內(nèi)，其活性所需最適 pH 9.2~9.8，堿性磷酸酶同工酶有肝、骨、小腸、胎盤、

膽汁等同工酶。堿性磷酸酶同工酶檢測試劑盒(抑制敏感法)采用磷酸苯二鈉比色法，其檢測原理是磷酸苯二鈉在堿性條件下，可在堿性磷酸酶的作用下生成游離酚和磷酸，在堿性條件下酚與氨基安替比林結(jié)合，并經(jīng)氧化生成紅色醌式結(jié)構(gòu)物，呈深淺不一的紅色，產(chǎn)物紅色越深說明堿性磷酸酶活性越高，反之則酶活性越低，通過比色法(分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀)測定 510nm 處吸光度，據(jù)此通過比色分析就可以計(jì)算出總的堿性磷酸酶活性水平；同時(shí)通過尿

素、苯丙氨酸抑制后測定殘余 ALP 活性，以確定同工酶的性質(zhì)，可用于檢測細(xì)胞或組織的

裂解液或勻漿液、血漿、血清等樣品中內(nèi)源性的堿性磷酸酶同工酶活性；如果用分光光度計(jì)，100T 的檢測試劑盒可檢測 33 次左右；如果用酶標(biāo)儀，100T 的檢測試劑盒可檢測 330 次左右。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、離心管或 96 孔板、水浴鍋或恒溫箱、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀

2、ddH2O 、PBS 或生理鹽水

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)勻漿，一般細(xì)胞數(shù)量在 106 以上，組織應(yīng)在 100mg 以上，3000~4000rpm 離心取上清，-20℃凍存，用于堿性磷酸酶同工酶的檢測。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定，尿液通常也可以直接用于測定，-20℃凍存，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設(shè)置加了血漿或血清但不加底物的對照。

③高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的堿性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 PBS等進(jìn)行稀釋，如雞血清、血漿可稀釋 5～10 倍后檢測。

2、配制 ALP 顯色試劑：臨用前將 ALP 顯色試劑 A 和 ALP 顯色試劑 B 按 1:2 比例混合即可，不宜長期保存。

3、配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液：取出 Phenol 標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)恢復(fù)至室溫后，取 0.1ml 溶解于 1.9ml ddH2O，即為 Phenol 標(biāo)準(zhǔn)(0.05mg/ml)，按照下表稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

4、分光光度計(jì)測定(檢測總 ALP)：按照下表設(shè)置對照管、標(biāo)準(zhǔn)管、尿素測定管、苯丙測定

管、總 ALP 測定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的堿性磷酸酶同工酶的活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定，樣品的檢測最好能設(shè)置平行管以 0 號管(ddH2O)調(diào)零，比色杯光徑 1cm，以分光光度計(jì)測定對照管、標(biāo)準(zhǔn)管、尿素測定管、苯丙測定管、總 ALP 測定管 510nm 處吸光度(即 A 對照、A 標(biāo)準(zhǔn)、A 測定)。如無法檢測 510nm，亦可檢測 500～530nm 范圍內(nèi)吸光度，一般應(yīng) 15min 內(nèi)檢測完畢。

5、酶標(biāo)儀測定(檢測總 ALP)：按照下表設(shè)置對照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、尿素測定孔、苯丙測定孔、 總 ALP 測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的堿性磷酸酯酶活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定，樣品的檢測最好能設(shè)置平行孔。

計(jì)算：堿性磷酸酶金氏活性單位的定義：在 37℃條件下，100ml 待測樣品與顯色底物(即

磷酸苯二鈉)作用 15min，產(chǎn)生 1mg 酚為一個(gè)金氏單位(U/L)。

以系列 Phenol 標(biāo)準(zhǔn)(1～6 號管)對應(yīng)的金氏單位為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的 A 標(biāo)準(zhǔn)(1～6 號管)

為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(亦可分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)。以(A 測定-A 對照)之差值為實(shí)際的吸光度，

用該差值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，求出總 ALP、 尿素抑制 ALP、苯丙抑制 ALP 活性單位。

尿素抑制 ALP 殘余活性百分率=尿素抑制 ALP 殘余活性/總 ALP 活性×100%

苯丙抑制 ALP 殘余活性百分率=苯丙抑制 ALP 殘余活性/總 ALP 活性×100%

注意事項(xiàng)：

1、 待測樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、 如果沒有分光光度計(jì)，也可以使用酶標(biāo)儀測定，但應(yīng)注意 96 孔板最大檢測體積，推薦采用分光光度計(jì)檢測。

3、 所測樣品的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，應(yīng)稀釋樣品后重新測定。

4、 如果空白管/孔顯紅色，說明 ALP 顯色液不可用，應(yīng)丟棄。

5、 加入顯色基液時(shí)應(yīng)迅速，并且及時(shí)混勻，否則顯色不充分。

6、 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個(gè)月有效。常溫運(yùn)輸，4℃保存。

 堿性磷酸酶同工酶檢測試劑盒(抑制敏感法)的產(chǎn)品組成