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組織細胞蛋白提取
描述:從組織細胞中提取總蛋白是 Western Blot 的關(guān)鍵步驟。實體軟組織如腦脊髓富含磷脂,神經(jīng)xue管含大量結(jié)締組織,而脂肪則含有大量油脂,常規(guī)的方法難以有效從這些組織中提取蛋白。本試劑盒為組織或培養(yǎng)細胞總蛋白提取提供完整的解決方案。用裂解-結(jié)合緩沖液勻漿裂解實體組織,或直接用裂解-結(jié)合緩沖液重懸培養(yǎng)細胞,然后加入抽提試劑去除非蛋白成分,離心、干燥后即可得到總蛋白。蛋白沉淀溶解后用常規(guī)方法進行蛋白定量。提取過程可在 30-60 分鐘內(nèi)完成,可在 1.5mL 離心管微量提取也可大規(guī)模制備,極為簡便高效。
規(guī)格: 50次 100次
儲存:室溫或4ºC 24個月有效
操作步驟:
固體組織蛋白提取
1. 每 10-100mg 固體組織剪碎后加入 0.5-1 mL 裂解液,放入玻璃勻漿器內(nèi)上下手動勻漿 15 次;或用高速機械勻漿器 12,000 rpm破碎組織。少量小的未破碎組織不影響后續(xù)抽提。注意:肝腎脾組織蛋白含量高,提取時應(yīng)加較少量的組織,一般不超過50 mg,否則形成的蛋白膜厚、致密且難溶。
2. 僅取 0.5mL 組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管,棄去剩余的組織勻漿液。每 0.5mL 組織勻漿液加入2倍體積的(1mL)抽提試劑充分混勻。室溫或 4ºC 靜置 10 分鐘,偶爾晃動。注意:(1)如組織量<10mg,在下一步離心時形成的蛋白膜易碎,靜置 30min 有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪組織時應(yīng) 4ºC 靜置 40min 以上以充分去除油脂。(3) 0.5mL 組織勻漿液獲得的蛋白足以進行幾十次 Western Blot。保證每 0.5mL 組織勻漿液加入 2 倍體積的(1 mL)抽提試劑是成功的關(guān)鍵。
3. 10,000 × g 4ºC 離心 10 分鐘,溶液分為上下兩相,兩相中間為蛋白膜。吸除上層液體;隨后用吸頭或針頭輕輕撥開蛋白膜,吸除下層液體。蛋白膜將附著于離心管壁。注意:(1)離心速度過高將使蛋白膜過于堅固,難以溶解。(2)如果不 能分相,可再加入 50μl 蒸餾水混勻離心。 (3)如果初始組織量較少(<10mg),離心后難以得到完整的蛋白膜,此時可吸
3.去上下層液體,加入 1mL 純乙醇混勻,10,000 × g 4ºC 離心 3 分鐘。棄所有液體,蛋白沉淀在管底。
4. 敞開管口,室溫空氣干燥沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分,可 4ºC 或-20ºC 一年以上。
說明
1. 按照上述提取和溶解過程,不加蛋白酶抑制劑,而蛋白不會有明顯降解,用戶不必(但可以)加入蛋白酶抑制劑。
2. 蛋白定量。注意使 SDS 濃度稀釋到不影響蛋白定量的水平,或選擇不受 SDS 影響的 BCA 定量方法。BCA 法<5% SDS濃度,Bradford 法<0.125% SDS 濃度。
3. 按比例可進行大規(guī)模的(多至1 g) 組織蛋白提取。
培養(yǎng)細胞蛋白提取 (參見固體組織蛋白提取程序中的斜體字注解)
1. 消化洗滌并 800 g 離心收集細胞。每 5-10 × 106 細胞加入 0.5 mL 裂解液,振蕩重懸,4ºC 凈置 2 分鐘。
2. 按比例每 0.5 mL 裂解液加入 1 mL 抽提試劑,振蕩混勻。4ºC 靜置 10min。
3. 10,000g 4ºC 離心 10 分鐘,溶液分為兩相,兩相中間為蛋白膜。小心吸除上層相和大部分下層相,保留兩相中間的蛋白絮狀物。如果不能分相,可再加入 50μl 蒸餾水混勻離心。
4. 加入 1 mL 純乙醇洗滌沉淀。10,000g 4ºC 離心 3 分鐘,蛋白沉淀在管底。
5. 去除管中所有液體,敞開管口,室溫空氣干燥蛋白沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分,可4ºC或-20ºC 一年以上。
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