緩沖液、試劑的配制方法

緩沖液、試劑的配制方法

#Solution III(質(zhì)粒提取用)#
組份濃度：3 M KOAc, 5 M CH3COOH
配制量：500 ml
配制方法：
1. 稱(chēng)量下列試劑，置于500 ml燒杯中。
2. 加入300 ml去離子水后攪拌溶解。
3. 加去離子水將溶液定容至500 ml。
4. 高溫高壓滅菌后，4℃保存。

#0.5 M EDTA(pH8.0)#
組份濃度：0.5 M EDTA
配制量：1 L
配制方法：
1. 稱(chēng)取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L燒杯中。
2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢琛?/span>
3. 用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0（約20 g NaOH)。
注意：pH值至8.0時(shí)，EDTA才能*溶解。
4. 加去離子水將溶液定容至1 L。
5. 適量分成小份后，高溫高壓滅菌。
6. 室溫保存。

#1 M DTT#
組份濃度：1 M DTT
配制量：20 ml
配制方法：
1. 稱(chēng)取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料離心管內(nèi)。
2. 加20 ml的0.01 M NaOAc（pH5.2)，溶解后使用0.22 mm濾器過(guò)濾除菌。
3. 適量分成小份后，-20℃保存。

#10 mM ATP#
組份濃度：10 mM ATP
配制量：20 ml
配制方法：
1. 稱(chēng)取121 mg Na2ATmiddot;3H2O，加入到50 ml塑料離心管內(nèi)。
2. 加20 ml的25 mM Tris-HCl（pH8.0)，攪拌溶解。
3. 適量分成小份后，-20℃保存。

#1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)#
組份濃度：1 M Tris-HCl
配制量：1 L
配制方法：
1. 稱(chēng)量121.1 g Tris置于1 L燒杯中。
2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?/span>
3. 按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需要的pH值。
4. 將溶液定容至1 L。
5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。
注意：應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門(mén)ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1℃，溶液的pH值大約降低0.03個(gè)單位。



#10&timeTE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)#
組份濃度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA
配制量：1 L
配制方法：
1. 量取下列溶液，置于1 L燒杯中。
2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，均勻混合。
3. 將溶液定容至1 L后，高溫高壓滅菌。
4. 室溫保存。

#1.5 M Tris-HCl (pH8.8)#
組份濃度：1.5 M Tris-HCl
配制量：1 L
配制方法：
1. 稱(chēng)量181.7 g Tris置于1 L燒杯中。
2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?/span>
3. 用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8。
4. 將溶液定容至1 L。
5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。
注意：應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門(mén)ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1℃，溶液的pH值大約降低0.03個(gè)單位。

#3 M 醋酸鈉(pH5.2)#
組份濃度：3M 醋酸鈉
配制量：100ml
配制方法：
1.稱(chēng)量40.8g NaAc·3H2O置于100-200ml燒杯中，加入月40ml的去離子水?dāng)嚢枞芙?/span>
2.加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.2
3.加去離子水將溶液定容至100ml
4高溫高壓滅菌后，室溫保存。


#Buffer#
組份濃度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4
配制量：1 L
配制方法：
1. 稱(chēng)量下列試劑，置于1 L燒杯中。
2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?/span>
3. 滴加濃鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4，然后加入去離子水將溶液定容至1 L。
4. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。
注意：上述 Buffer中無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子，如需要，可在配方中補(bǔ)充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。


#10 M 醋酸銨#
組份濃度：10 M 醋酸銨
配制量：100 ml
配制方法：
1. 稱(chēng)量77.1 g醋酸銨置于100～200 ml燒杯中，加入約30 ml的去離子水?dāng)嚢枞芙狻?/span>
2. 加去離子水將溶液定容至100 ml。
3. 使用0.22 mm濾膜過(guò)濾除菌。
4. 密封瓶口于室溫保存。
注意：醋酸銨受熱易分解，所以不能高溫高壓滅菌。


#Tris-HCl平衡苯酚#
配制方法：
1. 使用原料：大多數(shù)市售液化苯酚是清亮無(wú)色的，無(wú)需重蒸餾便可用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。但有些液化苯酚呈粉紅色或黃色，應(yīng)避免使用。同時(shí)也應(yīng)避免使用結(jié)晶苯酚，結(jié)晶苯酚必須在160℃對(duì)其進(jìn)行重蒸餾除去諸如醌等氧化產(chǎn)物，這些氧化產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂或?qū)е翿NA和DNA的交聯(lián)等。因此，苯酚的質(zhì)量對(duì)DNA、RNA的提取極為重要，我們推薦使用高質(zhì)量的苯酚進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2. 操作注意：苯酚腐蝕性*，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡等。所有操作均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，與苯酚接觸過(guò)的皮膚部位應(yīng)用大量水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。

3. 苯酚平衡：因?yàn)樵谒嵝詐H條件下DNA分配于有機(jī)相，因此使用苯酚前必須對(duì)苯酚進(jìn)行平衡使其pH值達(dá)到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下：
① 液化苯酚應(yīng)貯存于-20℃，此時(shí)的苯酚呈結(jié)晶狀態(tài)。從冰柜中取出的苯酚首先在室溫下放置使其達(dá)到室溫，然后在68℃水浴中使苯酚充分融解。
② 加入羥基喹啉（8-Quinolinol）至終濃度0.1%。該化合物是一種還原劑、RNA酶的不*抑制劑及金屬離子的弱螯合劑，同時(shí)因其呈黃色，有助于方便識(shí)別有機(jī)相。
③ 加入等體積的1 M Tris-HCl（pH8.0)，使用磁力攪拌器攪拌15分鐘，靜置使其充分分層后，除去上層水相。
④ 重復(fù)操作步驟③。
⑤ 加入等體積的0.1 M Tris-HCl（pH8.0)，使用磁力攪拌器攪拌15分鐘，靜置使其充分分層后，除去上層水相。
⑥ 重復(fù)操作步驟⑤，稍微殘留部分上層水相。
⑦ 使用pH試紙確認(rèn)有機(jī)相的pH值大于7.8。
⑧ 將苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。
苯酚/氯-仿/異戊醇 (25 : 24 : 1)
配制方法：
1. 說(shuō)明：從核酸樣品中除去蛋白質(zhì)時(shí)常常使用苯酚/氯-仿/異戊醇（25 : 24 : 1)。氯-仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離，而異戊醇則有助于消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的氣泡。
2. 配制方法：將Tris-HCl平衡苯酚與等體積的氯-仿/異戊醇（24 : 1）混合均勻后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。


#10% (W/V) SDS#
組份濃度：10% (W/V)SDS
配制量：100ml
配制方法：
1.稱(chēng)量10g高純度的SDS置于100-200ml燒杯中，加入約80ml的去離子水，68℃加入溶解
2.滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2
3.將溶液定容至100ml后，室溫保存。

#2 N NaOH#
組份濃度：2 N NaOH
配制量：100 ml
配制方法：
1. 量取80 ml去離子水置于100～200 ml塑料燒杯中（NaOH溶解過(guò)程中大量放熱，有可能使玻璃燒杯炸裂)。
2. 稱(chēng)取8 g NaOH小心地逐漸加入到燒杯中，邊加邊攪拌。
3. 待NaOH*溶解后，用去離子水將溶液體積定容至100 ml。
4. 將溶液轉(zhuǎn)移至塑料容器中后，室溫保存。

#2.5 N HCl#
組份濃度：2.5 N HCl
配制量：100 ml
配制方法：
1. 在78.4 ml的去離子水中加入21.6 ml的濃鹽酸（11.6 N)，均勻混合。
2. 室溫保存。


#5 M NaCl#
組份濃度：5 M NaCl
配制量：1 L
配制方法：
1. 稱(chēng)取292.2 g NaCl置于1 L燒杯中，加入約800 ml的去離子水后攪拌溶解。
2. 加去離子水將溶液定容至1 L后，適量分成小份。
3. 高溫高壓滅菌后，4℃保存。

#20% (W/V) Glucose#
組份濃度：20% (W/V) Glucose
配制量：100 ml
配制方法：
1. 稱(chēng)取20 g Glucose置于100～200 ml燒杯中，加入約80 ml的去離子水后，攪拌溶解。
2. 加去離子水將溶液定容至100 ml。
3. 高溫高壓滅菌后，4℃保存。

#Solution I(質(zhì)粒提取用)#
組份濃度：25 mM Tris-HCl（pH8.0), 10 mM EDTA, 50 mM Glucose
配制量：1 L
配制方法：
1. 量取下列溶液，置于1 L燒杯中。
2. 高溫高壓滅菌后，4℃保存。
3. 使用前每50 ml的Solution I中加入2 ml的RNase A（20 mg/ml)。


#Solution II(質(zhì)粒提取用)#
組份濃度：200mM NaOH，1%(W/V)SDS
配制量：500ml
配制方法：
1.量取下列溶液，置于500ml燒杯中
10% SD 50ml
2N NaOH50ml
2.加滅菌水定容至500ml，充分混勻
3.室溫保存，此溶液保存時(shí)間zui-好不要超過(guò)一個(gè)月
注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢?/span>